qPCR实验操作和文章发表指南:MIQE

  • A+
所属分类:研究方法

现在如何操作实时定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)实验和和解释其结果缺少一个共识。在很多发表的文章中缺乏足够的qPCR实验细节,这了妨碍了我们评估结果质量,或者让我们难以根据文章重复实验。正如科研动力曾经提到过Oncogene撤回一篇2010年的文章一事,如果杂志本身按照qPCR标准审查稿件,可能也不会发生这事儿。

由此可见有关qPCR制定一个实验和发表标准是多么的重要。不过幸好,Clin Chem. 2008年发表一篇文章,就是一群qPCR大牛经过商讨制定的qPCR实验和发表文章指南。虽然文章有些年限,但是对我们研究还是很有用的。因此科研动力打算在此贴出。

qPCR实验操作和文章发表指南:MIQE

这篇指南题为实时定量PCR实验研究发表最小信息(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, MIQE),目的就是为了帮助确认科学文献的完整性,提高不同实验室之间结果的一致性,并且提高实验的透明度。

MIQE是描述评估qPCR实验的所需的最小信息,该指南是稿件投稿时需要同时提交的一个清单。通过作者提供相关的实验相条件和实验特点,审稿人可以评价实验所用方法的可靠性。另外提供详细的实验所用试剂、序列和分析方法,其他研究人员可以利用这些信息进行重复实验。MIQE的细节应当作为在线发表的一个附件或者简要形式同时发表。

实时定量PCR可以通过荧光定量检测和测量微小量的核酸,适用范围很广,可以检测多种不同来源的组织样本,在分析诊断学,生命科学,农学和医学中应用很广,是一种优秀的技术方法。

因为qPCR操作简单,检测速度快,敏感性和特异性好,还可以对核酸定量的特点,qPCR已成为核酸定量实验的标准方法。qPCR除了作为一种研究方法,其在诊断中也有广泛应用,如微生物定量,基因定量,转基因食品中外源基因的鉴定,癌症复发的风险评估以及法医中的应用。

利用qPCR技术的研究文献也是数量惊人,这些文章使用不同的试剂,方法,分析法和报道格式。但是由于缺乏如何最佳的操作qPCR实验共识,qPCR一些不足可能会引起很多不良后果,这阻碍了qPCR成为一个独立的标飘走。影响qPCR检测性能的技术上的不足包括以下几点。

  • 缺少足够的样本,制剂和核酸质量,从而产生高度可变的结果。
  • 反转录引物和PCR引物以及探针选择性差,导致效率低下,与其强大的检测性能不成比例。
  • 不恰当的数据和统计分析,产生可能是高度误导的结果。

因此大量有关qPCR发表的文献中存在结果证据不足甚至是相互矛盾的结果,这对科学研究是一个很大的危险。科学文献的发表和撤回也为人们提出了警示。多数研究报告缺少足够的信息加剧了这个问题,使用qPCR的文献没有提供足够的实验细节,可以让读者评估结果的质量或者重复实验。具体表现为样本的采集和处理信息,RNA质量和完整性,反向转录细节,PCR效率,以及分析参数等等,这些信息常常被忽略,然而样本正规化是反对没有价值的单一参考基因。

本文的目的是为作者、审稿人和编辑提供一个最低限度的信息(附表,见文末,并且提供PDF和Excel版本下载),是qPCR实验必须附加的信息,以保证实验的实用性、准确性、正确的解释和可重复性。MIQE参照了类似的DNA微阵分析草案,蛋白组学实验指南,基因序列规范,以及有关RNA干扰和代谢组学讨论等内容。该指南最初都是在MIBBI (Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations, http://www.mibbi.org)基础上产生的。虽然很多指南最终会发展成强制数据分享使用同一格式,但是MIQE并不建议这样做。MIQE的目的是提高结果的可靠性,以资保证科学文献的完整性,提高不同实验室之间结果的一致性,以及提高实验的透明度。应当结合最近发表的文献阅读qPCR的指南,这样可以深度操作qPCR的标准化。

该指南由9部分组成,共85个参数,以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确的解释和可重复性。这9部分包括:实验设计(Experimental design),样本(Sample),核酸提取(Nucleic acid extraction),反转录(Reverse transcription),靶基因(qPCR target information),qPCR引物和探针(qPCR oligonucleotides),qPCR实验报告(qPCR protocol),qPCR合理性(qPCR validation)和数据分析(Data analysis)。85个参数视其对发表qPCR结果时的必要性,分为两类:标记为「E」表示必须(essential),标记为「D」者表示建议(desirable)。

1. 术语

首先先定义几个术语先以确保澄清事实。

1.1 实时定量PCR的简写

建议实时定量PCR (quantitative real-time PCR) 应当简写为qPCR,反转录PCR (reverse transcription–qPCR) 应当简写为RT-qPCR。用RT-PCR简写表示qPCR可以引起混乱,并且与传统RT-PCR的平常应用不符。

1.2 内参基因

内参基因应当指的是参照基因(reference genes),而不是管家基因(housekeeping genes)。

1.3 TaqMan探针

TaqMan探针应指的是水解探针(hydrolysis probes)。

1.4 FRET probe

FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 荧光共振能量转移探针)指的是一种机制,基于2个荧光基团的电子激发状态之间的相互作用的基础上的发光/淬火。LightCycler型探针指的是双杂交探针(dual hybridization probes) 。

1.5 定量 quantification

牛津英语词典只列出了定量(quantification),非定量(non-quantification),因quantification是恰当的。

1.6 Cq

现在文献中使用的阈值循环(threshold cycle, Ct),交点(crossing point, Cp)和分支点(take-off point, TOP) 与PCR反应周期中的术语不一致。这些术语指的实际上在实时仪器是相同的值,只是不同仪器厂家为了竞争给自己产品的特定定义,不具有准确性和清晰性。根据实时定量PCR的标记语言的数据标准(www.rdml.org),建议同一使用定量循环(quantification cycle, Cq)这个术语。

2. 概念

为了解释指南,我们回顾一下qPCR实验有关的一些关键性问题。

2.1 分析敏感性(Analytical sensitivity)

分析敏感性指实验准可以确测量样本的最小拷贝数,而临床敏感性(clinical sensitivity)指实验可以确定患种疾病的阳性人数的百分比。通常灵敏度表示为检测限(limit of detection, LOD),即分析方法可以检测浓度的合理定性(常用95%的概率)。最敏感的LOD理论上可能是3拷贝/PCR,假设符合泊松分布,PCR有95%的可能性至少包含和检测到1个拷贝。实验步骤通常包括样本处理(如提取),有时还需要反向转录过程。如果总量有变化,这些步骤的效率可以引起多数LOD敏感性变化,理论上表现在可能在与实验有关的单元上,如每克组织的拷贝数。不应报道实验结果少于理论上LOD可能性的结果。同样结果为「0」也是无意义和可引起误导的。因为当模板浓度是0时Cq是不确定的,在qPCR分析LOD的评估因Cq的对数而变得复杂。在qPCR中适当的确定和调节LOD是持续研究的重点。

2.2 分析特异性(Analytical specificity)

分析特异性指qPCR检测相应的靶序列而不是样本中其他同样表达的非特异性序列。诊断特异性是(Diagnostic specificity)指实验确定为阴性的没有某种疾病的百分比。

2.3 精度(Accuracy)

精度指实验测量和实际浓度之间的差异,代表了倍数变化或者估计拷贝数。

2.4 重复性(Repeatability)(短期精度或者批内变异(intraassay variance))

重复性指同样样本使用同样方法重复检测的精度和稳定性。可以用Cq的SD变化表示,也可用拷贝数或浓度变化的SD或者CV来表达。但是不能用CVs和Cqs表达。

注:批内变异指一个实验得到的一组数据的变异。每个样本测量多次,多次测量之间的差异。

2.5 再现性(Reproducibility)(长期精度或者批间变异(interassay variance))

再现性指不同实验室或者操作之间的结果变化,通常表现为拷贝数或浓度的SD或者CV。Cq值一般由不同操作产生,服从于固有的批间变异(interrun variation),因此单纯的报道批间Cq变化并不恰当。

文章中描述靶基因的mRNA浓度应该可以使靶基因更精确。多数人类基因和其他多核细胞生物中的很多基因的转录是选择性剪接,这些剪接变化可以改变蛋白质亚型,不同组织或者不同时期都有这种剪接模式的变化。因此单一外显子RT-qPCR法可能检测到许多剪接变化,但是内含子引物可能更有选择性,但是这又可能丢失一些剪接变异。最近有报道称常染色体非印迹基因(nonimprinted genes)表达时表现为等位基因失衡。总之,使用RT-qPCR评价一个靶基因或者最多2个外显子的mRNA不足以表现特定基因水平。因此作者要把引物序列信息及其相对于已知剪接体变化的特异性,以及单核核苷酸多态性位点等这些信息记录在案和单核核苷酸多态性数据库中。对于选自RTprimerDB数据库的引物设计倒很简单,直接查询RTprimerDB的网站(http://www.rtprimerdb.org)即可,这个数据库包含了所有相关的信息。如果是商业公司提供的引物,还需要提供一些信息以及供应商的实验验证标准。强烈不建议使用未验证的商业分析结果,以及仅有silico(这是什么鸟?)验证的商业分析。

必须记住的是检测mRNA提供不了是否mRNA能翻译成蛋白质的信息,或者实际上能翻译成一个功能蛋白质的信息。

免疫组化,免疫蛋白印迹法,或者其他蛋白质定量方法常不能定量细胞mRNA。现在已明确mRNA浓度和蛋白质浓度之间的一致性,特别是mRNAs和多功能蛋白质复合体中一个特定蛋白质之间的一致性。现在已明确特定microRNA是了解基因表达非常重要的,因为它量化mRNA种类。

还应注意多数RNA定量不是绝对的,而是相对的。由此用参考基因或者作为标准材料是至关重要的,任何评价RT-qPCR实验的有效性也必须考虑相对定量的参考基因。因此开发通用参考DNA和RNA标准材料,虽然很有用,但是不是一个万能药。

RT-qPCR实验产生的表达值的很多变异并不只是由于实验步骤的变异引起,而是由于不同数据处理算法的校正引起的,每个算法都是数据假设。因此虽然qPCR是试金石或者金标准,但是实际中这个标准是可变的,结果需要考虑分析和解释复杂性。

3. 研究和诊断应用

qPCR技术的应用可以大致分为研究应用和诊断应用。研究应用常用于分析量少的范围广泛的靶基因或者不同的样本类型的靶基因。主要是需要解决有关分析敏感性和特异性等参数,在这种情况下分别是可以检测多少个靶拷贝以及无模板对照(no-template controls, NTCs)是否确实是阴性。

诊断应用却是相反,它常用于分析一定数量的靶基因,但是需要一些样本靶基因是高产的。虽然研究应用也可用于诊断实验,但是临床诊断实验有额外的要求,如分析的敏感性和特异性,也就是指有靶基因标本能检测出多少阳性结果,以及无靶基因样本能检测出多少阴性结果。甚至不同实验室之间的准确度和精确度常由外部质量控制程度控制。临床实验室还要求可报告结果的标准,样本的是否重复检测,假阳性/假阴性结果的解决方法,多个实验室用于同样和不同技术结果的相似似性。迄今为止只有几个国际实验公司进行该类实验,并且这些研究重点在于qPCR诊断实验的标准化。另外欧盟SPIDIA项目(Standardisationand Improvement of Generic Preanalytical Tools and rocedures for In-Vitro Diagnostics; http://www.spidia.eu)也有些实验正在进行此类实验。

4. 样本采集、处理和制备

样本的采集可能是实验变异的第一个来源,特别是RNA实验,因为mRNA的特性易被样本的采集和处理而不稳定。建议新鲜组织可以保存在冰块中,这对RNA的质量和浓度没有多大的影响,但是虽然这种保存方法对一些mRNA和组织是有效的,它也不可能普遍应用。因此在样本采集时应当谨慎。由此应详细记录组织样本的采集以及是否及时处理等信息。如果样本没有及时处理,必须记录是如何保存的,以及在什么情况下保存了多长时间。

样本的简要说明也是必不可少的。例如一个肿瘤样本的显微镜镜检可以发现样本由肿瘤细胞组成的比例,这些信息也需要报道。

核酸的提取是第二个关键步骤。提取效率取决于足够的同质化,样本的类型(如原位组织和培养组织),样本密度,生理状态(如健康、癌症或者坏死),基因复杂性,以及处理量。因此必须记录核酸取方法的细节,以及检测核酸浓度和评估质量的方法。这些细节对从新鲜冰冻显微切割标本中提取RNA特别重要,因为组织提取过程对RNA的数量和质量影响很大。

5. 核酸质量控制

5.1 RNA样本

提取样本中的RNA定量分析很重要,因为比较不样本时,使用大致相似相同数量的RNA是明智的。平常使用的有几种量化方法,如分光光度法(NanoDrop; Thermo Scientific),微流控分析法(Agilent Technologies’ Bioanalyzer, Bio-RadLaboratories’ Experion),毛细管凝胶电泳法(Qiagen’s QIAxcel),或者荧光染料检测法(Am-bion/Applied Biosystems’ RiboGreen)。这些方法可以有不同的结果,因此用不同方法比较结果是不明智的。定量RNA推荐使用荧光RNA结合染料(如RiboGreen),该方法是检测低浓度样本最好的方法。建议任何情况下检测所有样本使用同一种方法,并且报道这些信息。

外源性基因组DNA污染程度和这种污染容忍的阈值也是很重要的。必须报道RNA样本是否经过DNase处理(包括DNase类型和反应条件),每个核酸样本的获得的Cqs研究组和非反转录的控制组的阳性果之间比较结果。

RNA模板的质量评估也是必不可少的,唯一例外当提取的总RNA质量太低以至于不能评价质量时。这种情况一般发生在从单一细胞、血浆或其它体液中提取RNA,以及一些激光捕获样本或者组织培养收集的样本提取RNA时。这种情况同样适用于RT-qPCR持续单管试验。需要报道RNA数量,融合和没有反转录或PCR抑制剂等关键信息。应该记住体内RNA降解是由于mRNA因自然刺激的自然调节。RNA降解是研究人员无法控制的,其表现之一是高质量的RNA样本可以表现单个mRNAs的不同降解。

A260/A280比值必须在中性PH值buffer中测量,但是这个比值如果于核酸用于定量分析,尤其是目的是为了测量细胞mRNA浓度的微小差异(<10倍)时,这个比值不够用。吸收度比值提供了RNA纯度指标,因为DN或者残余苯酚可以改变这个比率。因此至少应该提供凝胶电泳证据,或者更好能提供微流控芯片的rRNA分析结果,或者一个参考基因/靶基因3’:5’完整性检测。使用Bioanalyzer/Experion系统计算RNA完整性数量或RNA质量指标数量的优点是这些指标可以提供有关RNA样本一般状态的定量信息。但是要记住这些与rRNA质量有关的数字不能期望作为质量的绝对指标。使用3’:5’分析要求两个实验的PCR效率几乎相同,不受不同抑制剂的控制。这个实验还需要一个阈值来定义RNA质量产量不足可信结果。理想状太下检测目标是一组「可靠参考基因」,可能没有内含子,3’:5’的倍数大约是0.2-5。显然需要进一步的工作开发一个评价RNA完整性的工具,既有普遍适用性,又有成本效益和操作简单。

应当通过稀释样本(最好)检测反转录活性或者PCR抑制剂,或者使用一般的抑制试验如SPUD。如果RNA样本部分降解,这个信息必须报道,因为实验的低水平转录检测敏感性可能减少,转录的降解的相对差异可能引起不正确的比率。

5.2 DNA样本

一般情况下DNA降解比较少,但是法医学评价外源性DNA降解是重要的,如恶劣环境犯罪或者大规模灾害,或者涉及失踪人员案件中,DNA化学结构可能出现降解。qPCR扩增片段大小可以帮助减少测定有关的问题,但是开发供DNA质量的定量检测方法可用于这种特殊用途。

可能的抑制剂是更普遍可变因素,必须在发表中指出,没有抑制剂纯化的DNA可能会扭曲结果,比如病原体的检测和量化。虽然可以添加样本与阳性对照来检测抑制剂,但是不同的PCR反应可能会受抑制剂影响。因此最好是常规使用核酸稀释来证明Cqs或拷贝数的减少是与预期结果一致的。

6. 反转录

反转录步骤可以引起RT-qPCR的实质性变异。因此详细描述转化RNA成cDNA的方法和试剂是必不可少的。RNA反转录的量,启动策略,酶的类型,数量,温度,持续时间和反转录步骤等等这些信息必不可少。建议反转录步骤可以进行次或者三次,每个样本中总RNA浓度应是相同的。

7. qPCR

以下信息qPCR试验必须提供的:数据库登陆每个靶基因和参考基因的数目,每个引物和任何探针的外显子位点,每个寡核苷酸的浓度和序列,包括性质、位点和结合任何染料和/或修饰碱基。同样需要聚合酶的名称和浓度,每个反应的模板(DNA或RNA)数量,Mg2+浓度,缓冲液中确切化学组成(盐、PH值、添加剂),以及反应量。研究人员还必须确认他们所使用的仪器,所有PCR循环条件的文件。因为所使用的耗材影响热循环,必须确定使用单一试管、带或者板,以及它们的制造商。所使用的塑料制品的透明度,如白色或者透明,这也重要,因为不同的塑料的荧光反射敏感性不同。当使用板时,密封(热粘合或粘合剂)的方法可以影响板周边样品的蒸发,这也要记录。

因为PCR效能高度依赖于所使用的引物,因此引物的序列必须发表。这个要求是完全可行的,甚至是商业性的引物,因为有先例(http://www.primerdesign.co.uk/research_with_integrity.asp)。

另外强烈建议提交给公共数据库,如RTprimerDB,这些数据库可以成为通用的交换所。

7.1 二级结构

目标核酸的结构(如RNA的茎环结构)对反转录和PCR的效率有重要影响。因此,引物和探针的位点,以及PCR扩增产物的位点必须考虑RNA的折叠。可以用核苷酸折叠软件仔细核实序列,这类软件有DNA的mfold(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi),或者RNA的mfold(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1-2.3.cgi)。理想状态下折叠结构应该提供给审稿人。

7.2 特异性

In Silico 工具如 BLAST 或者等效性搜索是实验设计有用的。应当记录任何可预测的假基因的同源或者其它不可预见的基因,并且作为一个序列比对提供给审稿人。但是特异性必须用直接的实验证据(凝胶电泳,解链曲线图形,DNA序列,扩增片段大小,和/或限制性酶切)验证有效性。

设计之初可预测寡核苷酸的熔解温度(Tm)的算法,但是退火的实际最佳温度必须通过实验决定。虽然引物优化已成为过去时,但是不当的退火温度优化对实验质量有很大的影响还是明确的。引物二聚体的显可引起PCR低效率,在探针和SYBRGreen Ⅰ的实验中可能产生假阳性。引物优化的一些证据应提给审稿人,最好还要提交退火温度或者Mg2+浓度,Cq值,荧光点阵图与循环次数,和/或熔解曲线。

7.3 控制和量化标准

除了RT-qPCR实验上面所提到的非反转录控制外,所有qPCR反应还需要更多的控制和/或量化标准。在SYBR Green I反应中应当用探针区别预期PCR产物中区别不可预知的扩增产物(如引物二聚体)时,应用NTCs检测PCR污染。NTCs应当包含在每个板或者批样品中,并建立拒绝条件。如果Cq值未知最高值为35,那么如NTCs的Cqs≧40可以忽略。

从实验样本中提取的核酸的阳性对照可用于监测实验随时间变化,并且当每次操作不执行校准曲线时阳性对照就必不可少。

量化校准器可以纯化靶分子,如RNA合成或DNA寡核苷酸生成完整PCR扩增,质粒DNA结构,cDNA克隆成质粒,RNA体外转录,参考RNA,特定生物样品的RNA或者DNA,或者国际公认的生物标准(如果有)。稀释到规定tRNA载体(酵母或者10-100ng/L的大肠杆菌)浓度。为了检测人的病原体,避免引起载体tRNA出现溶解,校准可以稀释成阴性对照样本RNA或者DNA,或者把它们稀释到健康人的血浆。特定模板的稀释可为存储作准备,能抵抗几个冻溶循环。当Cq变化0.5-1.0时准备几个新鲜稀释。另外在4℃存储一周,超过一周就要丢弃。

qPCR用于诊断分析应包括一个独立的校正标准, 一般位于实验的线性区间内。同样也建议阳性和阴性提取对照。

7.4 检测性能

必须确定下面的实验特性:PCR效率,线性动态范围,LOD,精度。

7.4.1 PCR效率

稳定和精确的qPCR实验常和PCR效率有关。当靶基因相对于参考基因的mRNA浓度时PCR的效率特别重要。△△Cq法是基于单一参考基因的标准化最流行确定不同浓度样本的差异性的方法。计算靶基因和参考基因Cq值(△Cq)的差异,直接比较不同样本△Cqs。扩增两个基因以比较这两个基因的效率。但是最流行的方法不一定是最合适的,不过现在已开发替代的定量模型用于纠正扩增效率,还可以使用多个参考基因。

PCR扩增效率必须建立校准曲线,因为这种校准提供了一个简单、快速以及可重复PCR效率、分析敏感性和实验的稳定性的平均指标。效率放大应当从l校准曲线的og线性部分的斜坡部分决定。具体而言PCR效率=10-1/slop-1,初始模板浓度的对数(独立变量)是X轴,Cq(依赖变量)是Y轴。理论最大值为1.00(或100%)表示每个周期的产物量加倍。理想状态下PCR的估计平均效率的CIs或SEs服从校准曲线。

每个量化目标的校准曲线必须包含在提交稿件中,这些信息审稿人可以看到。校准曲线的斜率和Y截距必须包含在发表中。不同PCR效率可以产生不同的校准曲线和不同的斜率。因此靶基因和参考基因的Cq值不同可以保持不变,但是模板量是变化的,计算相对浓度是不准确的,易产生误导性结果。

Cq>40是可疑的,因为扩增效率低。使用这种Cq值是不理想的,因为它们可能太低(没有有效的结果)或者太高(假阳性结果增加)。

7.4.2 线性动态范围

反应的动态范围是线性的(最高到最低量化的拷贝数通过校准曲线表示)。根据生成校准曲线的模板,动态范围应当包括至少3个数量级,理想状态5或6 log10浓度。校准曲线的线性间隔必须包括目标核酸量化的间隔。因为量化的低限常不明确,应当确定线性间隔内最低浓度的变化。必须报道相关系数(r2值),理想是CIs应当通过整个线性动态范围。

7.4.3 LOD

LOD为检测到阳性样本最低浓度为95%。换句话说,包含一组靶基因复制内LOD的浓度最多不超过5%失败反应。低拷贝PCRs是随机有限的,不可能出现LODs为3个拷贝/PCR。如果是多个反应,可通过数字PCR得到低浓度的准确定量。实际上浓度校准器可以通过检测有限的稀释,失败和成功反应的百分比符合Poisson分布。

7.4.4 精度

很多因素可以解释qPCR结果的变异,包括温度的差异可影响退炎和/或变性,浓度不同可由移液浓度错误引起,以及随机变异。qPCR精度的一般随着拷贝数减少而变化。理想状态是实验内变异(重复性)在图中应当表现为标准误,或者重复样本的在校准曲线作为CIs。CVs不能用作Cqs,但是可用于表达拷贝数或浓度的变化。这种技术上的变化应该有别于生物变异。生物复制可直接解决不同组或治疗组之间的qPCR结果的统计学差异。诊断分析,报道不同部位和不同操作者之最批间精度(重复性)可能同样是必须的。

7.4.5 多重qPCR

qPCR分析的能力可以扩展到多重的,特别是就应用于同时检测点突变或多态性检测。多重需要提供证据表明多个目标的准确量化在单一管中不受损,比如检测效率和LOD是相同的,当检测单工模式时。当靶基因浓度很低又和高浓度的靶基因同时扩增时这个问题尤其重要。

8. 数据分析

数据分析包括原始数据检查,其质量和可靠性评估,以及可值得报告结果的产生。数据采集和提交的变异策略已描述过了,系统性评价显示qPCR的数据分析方法不同于其性能。

数据分析方法和可信度估计的详细信息是必须的,同时所使用的软件说明书。确定殿堂值和如何处理这些数据的方法必须指出。记录实验精度需要确认用于评价变异的统计方法(如95% CIs)和相应的浓度或Cq值的出现。这些信息应包括重复性和再现性数据,如果可用。如上所述,报告CVs为Cqs是不恰当的,因为Cqs常低于(因此可能误导)CVs计算的拷贝数量值。信息必须提供用于评价准确性的方法,包括组间差异的统计学意义。

8.1 规范化(Normalization)

规范化是一个可知的qPCR检测重要的组成部分,因为这个过程控制提取的变化,反转录的量,扩增效率,从而可以通过不同样本比较mRNA浓度。使用参考基因作为内部控制是最常用规范化细胞mRNA数据的方法,但是虽然使用参考基因被大多数适当规范化策略所接受,但是它们的用途必须为特定的组织或者细胞和特定的实验设计经实验验证其有效。不幸的是虽然大家越来越意识到系统性确认的重要性,大家也知道使用不恰当的参考基因作为规范有潜在的高度误导性,但是很多人还是一直忽视这些因素。因此很多分子分析仍然包含没有规范化的qPCR数据。

规范化涉及到报告研究基因和参考基因RNA浓度的比率。参考基因的mRNA应当稳定表达,它们的丰度应当和样本中mRNA总量强相关。

规范化反对使用一个参考基因,除非研究人员有明确的给审稿人提供明确的证据,证实其在实验条件下保持不变。参考基因最佳数量和选择必须经过实验测定和报告的方法来证实。

8.2 变异性

生物系统内在的变异可能竞争或者超过实验两组间的差异。当多个生物提制用于增加实验的统计差异性时,这种变化更易观察到。虽然生物复制之间的差异可能很大,但是足够数量的样本可以减少实验差异性。最近一份研究提供了处理这些数据的范例,如何从高生物变异实验样本中提取有意义的数据。很多因素可以引起实验变异,影响生物复制的数量以实现给定的统计结果。因此效率分析对决定样本数量是有用的,对可靠的结果是必须的。

8.3 定性分析

PCR的使用仅检测核酸模板的存在,而不是准确量化,被称为定性PCR,现在广泛用于病原体的诊断。PCR方法定性/定量分层总是一个准确是/否答案,需要低敏感性PCR实验的敏感性的信息。因此甚至定性分析应当提供实验操作的特性,特别是在7.4.2和7.4.3中讨论的要点。

结论

现大大家认为必须确保qPCR和RT-qPCR实验的质量。qPCR和传统的PCR之间最主要的不同是qPCR量化靶基因更准确。由于这种差异,一个不能认为传统的PCR可以直接转换成qPCR模式。表提供了作者发表qPCR研究的准备清单。E项目是必须,不仅可以让研究人员评价工作,还可以让其他研究人员可以重复实验。项目D同样重要,建议研究中考虑这些条目。当然运用常识也很重要:上百个基因的初始筛选完成表中的所有项目到是不必要。但是一旦限制了靶基因(少于20个),实验应当按照清单中的要求进行,清单还可以在http://www.rdml.org/miqe.php查看。

总之这个指南的目的有3个:

1. 为了让作者设计和发表qPCR实验有更大的内在价值。

2. 为了让审稿人和编辑可以评估技术质量和不按既定标准的提交稿件质量。

3. 为了遵循这个指南的作者已发表研究更易重复。

因此研究人员使用这个广泛使用技术可以产生更规范,更可比的,更可知的数据。

附表:作者、审稿人和编辑MIQE清单

MIQE checklist for authors, reviewers, and editors

Item to checkImportance
Experimental design
Definition of experimental and control groupsE
Number within each groupE
Assay carried out by core lab or investigator's lab?D
Acknowledgement of authors' contributionsD
Sample
DescriptionE
Volume/mass of sample processedD
Microdissection or macrodissectionE
Processing procedureE
If frozen - how and how quickly?E
If fixed - with what, how quickly?E
Sample storage conditions and duration (especially for FFPE samples)E
Nucleic acid extraction
Procedure and/or instrumentationE
Name of kit and details of any modificationsE
Source of additional reagents usedD
Details of DNase or RNase treatmentE
Contamination assessment (DNA or RNA)E
Nucleic acid quantificationE
Instrument and methodE
Purity (A260/A280)D
YieldD
RNA integrity method/instrumentE
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcriptsE
Electrophoresis tracesD
Inhibition testing (Cq dilutions, spike or other)E
Reverse transcription
Complete reaction conditionsE
Amount of RNA and reaction volumeE
Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentrationE
Reverse transcriptase and concentrationE
Temperature and timeE
Manufacturer of reagents and catalogue numbersD
Cqs with and without RTD*
Storage conditions of cDNAD
qPCR target information
If multiplex, efficiency and LOD of each assayE
Sequence accession numberE
Location of ampliconD
Amplicon lengthE
In silico specificity screen (BLAST, etc)E
Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs?D
Sequence alignmentD
Secondary structure analysis of ampliconD
Location of each primer by exon or intron (if applicable)E
What splice variants are targeted?E
qPCR oligonucleotides
Primer sequencesE
RTPrimerDB identification numberD
Probe sequencesD**
Location and identity of any modificationsE
Manufacturer of oligonucleotidesD
Purification methodD
qPCR protocol
Complete reaction conditionsE
Reaction volume and amount of cDNA/DNAE
Primer, (probe), Mg++ and dNTP concentrationsE
Polymerase identity and concentrationE
Buffer/kit identity and manufacturerE
Exact chemical constitution of the bufferD
Additives (SYBR Green I, DMSO, etc.)E
Manufacturer of plates/tubes and catalog numberD
Complete thermocycling parametersE
Reaction setup (manual/robotic)D
Manufacturer of qPCR instrumentE
qPCR validation
Evidence of optimisation (from gradients)D
Specificity (gel, sequence, melt, or digest)E
For SYBR Green I, Cq of the NCTE
Standard curves with slope and y-interceptE
PCR efficiency calculated from slopeE
Confidence interval for PCR efficiency or standard errorD
r2 of standard curveE
Linear dynamic rangeE
Cq variation at lower limitE
Confidence intervals throughout rangeD
Evidence for limit of detectionE
If multiplex, efficiency and LOD of each assayE
Data analysis
qPCR analysis program (source, version)E
Cq method determinationE
Outlier identification and dispositionE
Results of NTCsE
Justification of number and choice of reference genesE
Description of normalisation methodE
Number and concordance of biological replicatesD
Number and stage (RT or qPCR) of technical replicatesE
Repeatability (intra-assay variation)E
Reproducibility (inter-assay variation, %CV)D
Power analysisD
Statistical methods for result significanceE
Software (source, version)E
Cq or raw data submission using RDMLD

注:

1. All essential information (E) must be submitted with the manuscript. Desirable information (D) should be submitted if available. If primers are from RTPrimerDB, information on qPCR target, oligonucleotides, protocols, and validation is available from that source.
2. FFPE, formalin-fixed, paraffin-embedded; RIN, RNA integrity number; RQI, RNA quality indicator; GSP, gene-specific priming; dNTP, deoxynucleoside triphosphate.
3. Assessing the absence of DNA with a no–reverse transcription assay is essential when first extracting RNA. Once the sample has been validated as DNA free, inclusion of a no–reverse transcription control is desirable but no longer essential.
4. Disclosure of the probe sequence is highly desirable and strongly encouraged; however, because not all vendors of commercial predesigned assays provide thisinformation, it cannot be an essential requirement. Use of such assays is discouraged.

*: Assessing the absence of DNA using a no RT assay is essential when first extracting RNA. Once the sample has been validated as RDNA-free, inclusion of a no-RT control is desirable, but no longer essential.

**: Disclosure of the probe sequence is highly desirable and strongly encouraged. However, since not all commercial pre-designed assay vendors provide this information, it cannot be an essential requirement. Use of such assays is advised against.

相关下载:

MIQE_checklist PDF版本:链接: http://pan.baidu.com/s/1c0IvCqs 密码: k419

MIQE_checklist Excel版本:链接: http://pan.baidu.com/s/1mgILtqC 密码: axk9

本文编译于:Bustin SA et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797. Epub 2009 Feb 26. PMID:19246619

我了了个去的,真是痛苦啊。我只有一句话,千万不要涉及自己不是很熟的领域,不然结果很蛋疼。文中肯定存在着很多错误,大家将就着看看吧,有点收获当然好,没有收获也别骂我浪费时间。有时间大家可以看看这个杂志的原文,对于qPCR无论是研究还是理解,甚至是审稿,我认为还是不错的。

weinxin
公众号
科研动力微信公众号,欢迎关注!

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

目前评论:2   其中:访客  2   博主  0

    • avatar 科研动力网友 9

      不明觉厉

      • avatar 互传电商网 1

        不明觉厉